摘要： 在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，會出現(xiàn)這樣那樣的問題。比如經(jīng)常有人問:一定要做五點(diǎn)嗎？線性相關(guān)系數(shù)r值必須達(dá)到多少個(gè)9？你每天還是每次都做音樂？曲線一定要經(jīng)過原點(diǎn)嗎？……本文梳理了標(biāo)準(zhǔn)音樂的相關(guān)...

在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，會出現(xiàn)這樣那樣的問題。比如經(jīng)常有人問:一定要做五點(diǎn)嗎？線性相關(guān)系數(shù)r值必須達(dá)到多少個(gè)9？你每天還是每次都做音樂？曲線一定要經(jīng)過原點(diǎn)嗎？……

本文梳理了標(biāo)準(zhǔn)音樂的相關(guān)問題，

讓我們來看看！

1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的依據(jù)？

GB/T22554-2010中基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性校準(zhǔn):

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍應(yīng)覆蓋正常操作條件下的測量范圍；

2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的成分盡可能與被測樣品的成分一致；

3)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度值應(yīng)等距分布在測量范圍內(nèi)；

4)標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)量應(yīng)至少有3個(gè)濃度；

5)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)至少重復(fù)兩次，這個(gè)重復(fù)是指從稀釋開始；

如果國家標(biāo)準(zhǔn)有相應(yīng)的濃度系列推薦，盡量按照國家標(biāo)準(zhǔn)。我們在工作中經(jīng)常使用線性校準(zhǔn)，因?yàn)榫€性方程是最簡單的。

2.什么是校準(zhǔn)曲線？

校準(zhǔn)曲線包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線。前者不經(jīng)過預(yù)處理過程，直接用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，往往對樣品造成較大誤差。后者中使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品經(jīng)過了相同的消化、凈化和測量過程。

3.首先，你要做多少分才能給這首歌打分？

標(biāo)準(zhǔn)曲線需要幾個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這些數(shù)據(jù)點(diǎn)與被檢測組分的濃度范圍、分析儀的響應(yīng)特性、干擾因素、濃度和檢測信號的響應(yīng)類型有關(guān)。

3點(diǎn):對于一些低濃度，特別是微量分析，且濃度范圍不是很大，檢測器響應(yīng)可靠，背景干擾很小的，可以選擇較少的工作點(diǎn)。一般3個(gè)集中點(diǎn)就夠了，有的甚至可以只用一個(gè)集中點(diǎn)，另一個(gè)點(diǎn)直接用坐標(biāo)原點(diǎn)。

4~6分:如果平時(shí)測得的樣品濃度范圍較寬，檢測器的響應(yīng)不完全是線性曲線(直線)，可采用二次曲線或分段校正的方法，以減少數(shù)據(jù)偏差。在這種情況下，需要使用更多的數(shù)據(jù)點(diǎn)。如果不分段，4~6個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)就夠了。

至少兩點(diǎn):但如果是分段校正，每段至少需要兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。對于一些沒有固定濃度范圍的樣品，特別是一些檢測機(jī)構(gòu)，如果分析儀的檢測響應(yīng)可靠，環(huán)境因素影響不大，可以做一個(gè)校準(zhǔn)曲線。如果環(huán)境因素影響較大，可以不制作校準(zhǔn)曲線，而采用標(biāo)準(zhǔn)加入法或標(biāo)準(zhǔn)加入-一次稀釋法更簡單。

其實(shí)我們一般做五點(diǎn)(不包括零濃度)；以一般檢出限的5~10倍為第一點(diǎn)，再增加1倍。最高濃度為最低濃度的10~20倍為宜(以理化分析實(shí)驗(yàn)為例)。當(dāng)然要根據(jù)儀器的靈敏度來調(diào)整。

4.標(biāo)準(zhǔn)歌的R值多少個(gè)9才算合格？

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)(方法)的要求，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)覆蓋測試樣品的濃度范圍。如果對檢測標(biāo)準(zhǔn)(方法)沒有具體要求，至少用5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品(除空白)建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每一點(diǎn)重復(fù)測定1-3次。對于篩選方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.98，對于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。

其實(shí)大于0.99是判斷是否線性相關(guān)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)際應(yīng)用中，線性度大于0.999是理想的。線性范圍0.99-0.999的監(jiān)測結(jié)果只有在接近最高濃度(中間濃度)一半的位置才是準(zhǔn)確的。如果線性度大于0.999，則在整個(gè)線性范圍內(nèi)都會有令人滿意的結(jié)果。

如果檢測的線性不好，可以縮小標(biāo)準(zhǔn)的覆蓋范圍，將標(biāo)準(zhǔn)的濃度調(diào)整到待測樣品的濃度附近，這樣結(jié)果也很準(zhǔn)確。比如樣品的濃度在20ppb左右，但標(biāo)準(zhǔn)曲線建立在0~50ppb范圍內(nèi)，線性度卻很不理想。此時(shí)可將標(biāo)準(zhǔn)量程調(diào)整到15~25ppb，可做五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢驗(yàn)？

(1)線性測試:

即檢查校準(zhǔn)曲線的精度。對于由4 ~ 6個(gè)濃度單位得到的測量信號值繪制的校準(zhǔn)曲線，分光光度法一般要求其相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9990，否則應(yīng)找出原因并進(jìn)行修正，重新繪制合格的校準(zhǔn)曲線。

(2)攔截檢查:

即檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，在通過線性檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=a+bx，然后用t檢驗(yàn)截距A和0，當(dāng)取95%置信水平，檢驗(yàn)后無顯著差異時(shí)，可將A視為0，方程簡化為y=bx，移動項(xiàng)得到x=y/b。在線性范圍內(nèi)，不用查閱校準(zhǔn)曲線，直接用空校正樣品的實(shí)測信號值，計(jì)算樣品濃度。

當(dāng)A和0之間存在顯著差異時(shí)，校準(zhǔn)曲線的回歸方程的準(zhǔn)確度不高。找出原因并糾正后，重新繪制校準(zhǔn)曲線，通過線性測試。計(jì)算回歸方程，通過截距檢驗(yàn)后，投入使用。

如果回歸方程不經(jīng)過上述檢驗(yàn)和處理就直接投入使用，肯定會給測量結(jié)果引入一個(gè)差值，相當(dāng)于求解了a的系統(tǒng)誤差。

(3)坡度測試:

即檢驗(yàn)分析方法的靈敏度，方法的靈敏度隨實(shí)驗(yàn)條件的變化而變化。在相同的分析條件下，僅由操作中的隨機(jī)誤差引起的斜率變化不應(yīng)超過一定的允許范圍，該范圍隨分析方法的精度而變化。比如一般情況下，分子吸收分光光度法的相對差值小于5%，而原子吸收分光光度法的相對差值小于10%。

6.標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期的規(guī)定？

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線屬于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制范圍。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)可和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》中的結(jié)果控制要求，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考物質(zhì))定期用于監(jiān)測和/或低于標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)(參考物質(zhì))用于內(nèi)部質(zhì)量控制。

(2)《導(dǎo)則》中沒有規(guī)定“定期”，所以如果是“定期”，就要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況來確定。

(3)既然指南中沒有說明，那么按照一般的分析教材，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件(包括試劑、人員、儀器等。)改變，最好重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來說，儀器使用時(shí)間長，經(jīng)過驗(yàn)證，會處于穩(wěn)定狀態(tài)，而人員的藥物變化往往會比較大。如果說每次換人操作都要改曲線，那工作量就太大了。

7.每次開機(jī)都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

從藥物測試的要求來看，因?yàn)?

1.流動相每天都會不一樣，導(dǎo)致出峰時(shí)間和峰面積有一定的差異。

2.探測器的光能也在不斷減弱，所以它的日對應(yīng)值也不一樣，它的峰面積也不一樣。

基于以上原因，原則上每天都要對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。

不要每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但每次都必須輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品；因?yàn)槟愕牧鲃酉嗖豢赡苊看味己驮瓉淼囊荒Ｒ粯樱瑑x器的狀態(tài)也在變化，不同批次之間的保留時(shí)間是不一致的，所以你必須用附帶的標(biāo)準(zhǔn)來定位和定量。

8.校準(zhǔn)曲線可以長期使用嗎？

每批樣品應(yīng)測量標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度在校準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)。測量濃度和校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度之間的相對誤差不應(yīng)超過規(guī)定范圍。如果超過規(guī)定的相對誤差，應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線。

也可以說，分析項(xiàng)目和方法不同，校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性也不同。如果校準(zhǔn)曲線的斜率相對穩(wěn)定，則在樣品分析過程中只能測量兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。當(dāng)這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與原曲線對應(yīng)點(diǎn)的相對偏差小于5%時(shí)，可以使用原校準(zhǔn)曲線。因此，在樣品分析之前，有必要根據(jù)斜率的穩(wěn)定性來確定是否應(yīng)同時(shí)制作校準(zhǔn)曲線。

我們一般的做法是根據(jù)測試的頻率來做。如果項(xiàng)目要每天測試，測試量大，要求每周至少做一次曲線。如果一個(gè)月沒有幾單，那么一個(gè)月做一次曲線。當(dāng)然，如果儀器出現(xiàn)故障，大修回來，經(jīng)過驗(yàn)證，曲線需要重做。

9.標(biāo)準(zhǔn)曲線一定要經(jīng)過原點(diǎn)嗎？

標(biāo)準(zhǔn)曲線不一定要經(jīng)過原點(diǎn)，只要線性好就行。因?yàn)槟阕隹瞻椎脑?，基本不會越過原點(diǎn)。穿過原點(diǎn)是強(qiáng)制性的，但實(shí)際曲線可能不會通過，這將導(dǎo)致錯(cuò)誤。但起源是由于系統(tǒng)誤差。

是否穿越原點(diǎn)(0，0)的問題，可以從原點(diǎn)(0，0)所代表的意義來考慮:

即當(dāng)被測組分的濃度為零時(shí)，信號響應(yīng)值(即液相色譜的峰高或峰面積)是否也為零。一般來說，色譜分析屬于這種情況，所以可以將點(diǎn)(0，0)作為一個(gè)濃度水平納入標(biāo)準(zhǔn)曲線(甚至不需要配制零濃度的注射用標(biāo)準(zhǔn)溶液)，這也是單點(diǎn)法的一個(gè)依據(jù)。但是，類似的情況，用光譜測定的話，就說不通了。濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)溶液(背景)的響應(yīng)信號(吸光度)往往不為零，所以此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不一定過原點(diǎn)。

10.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍？

線性范圍大家都很清楚，主要是從相關(guān)系數(shù)R來看，一般要求R大于等于三個(gè)九。在以前的實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)候濃度高的時(shí)候，線性不好。高濃度點(diǎn)不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，而是在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，離擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)。在這種情況下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)很差，有時(shí)只有9。最后，我想通了。如果我手動擬合，用一條光滑的曲線把所有點(diǎn)連接起來，你會發(fā)現(xiàn)，如果在線性范圍內(nèi)，連接的就是一條直線；如果超出線性范圍，則連接為曲線。

1.相關(guān)系數(shù)的有效數(shù)字？

GB 5750.3-2006第8.2.7項(xiàng)有如下規(guī)定:校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)只是省略，保留到小數(shù)點(diǎn)后出現(xiàn)9以外的數(shù)字，如0.99989→0.9998。如果所有小數(shù)位都是9點(diǎn)，最多保留4位小數(shù)位。

12、Y=bX與二次曲線的選擇？

我們通常用Y=a+bX作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線擬合后要做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，完成線性檢驗(yàn)和偽擬合檢驗(yàn)，然后做A和0的差異檢驗(yàn)。如果A和0沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以考慮用Y=bX作為擬合曲線，擬合后做同樣的線性檢驗(yàn)和偽擬合檢驗(yàn)。如果線性測試合格(P0.05)，那么可以用Y=bX。

圓錐曲線的采用也是如此。如果你的擬合在Y=a+bX時(shí)不合格，你就要考慮用Y=a+bX+cX2，做同樣的不匹配測試，檢查擬合符合性。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗(yàn)和誤擬合檢驗(yàn)，則采用Y=a+bX的形式，以最少的統(tǒng)計(jì)參數(shù)符合統(tǒng)計(jì)簡單性原則。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，特別適合大量樣品的分析。然而，色譜條件(檢測器的響應(yīng)性能、柱溫、流動相的流速和組成、樣品體積、柱效率等。)對每個(gè)樣本的分析很難做到完全相同，因此很容易造成較大的誤差。此外，在繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，一般采用待測組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品(或已知準(zhǔn)確含量的樣品)，而實(shí)際樣品的成分差異很大，所以肯定會給測量帶來一定的誤差。

知道了各分析項(xiàng)目的校準(zhǔn)曲線斜率的穩(wěn)定性和影響穩(wěn)定性的主要因素，就可以決定原校準(zhǔn)曲線是否可以用標(biāo)點(diǎn)符號來檢查，省略了重新制作校準(zhǔn)曲線。從校準(zhǔn)曲線斜率的變化，可以判斷標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性，并確定其校準(zhǔn)周期。分析低濃度樣品時(shí)，應(yīng)使用高純水和試劑，以降低空的白色值和樣品的分析誤差。

科學(xué)使用校準(zhǔn)曲線對降低分析成本、提高檢測質(zhì)量具有重要意義。